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Cédric SARAZIN 1, 2, 3, 4, Nathalie DELAUNAY 2, 3, 4, *, Christine COSTANZA 1, Véronique EUDES 1 2, 3, 4 et Pierre GAREIL Analyses d explosifs par microsystèmes électrophorétiques RÉSUMÉ La menace terroriste
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Cédric SARAZIN 1, 2, 3, 4, Nathalie DELAUNAY 2, 3, 4, *, Christine COSTANZA 1, Véronique EUDES 1 2, 3, 4 et Pierre GAREIL Analyses d explosifs par microsystèmes électrophorétiques RÉSUMÉ La menace terroriste contre les pays occidentaux s est accrue durant les 20 dernières années. Un travail important a été mené afin d améliorer la réactivité des secours face à un attentat. Cette réactivité nécessite notamment une identification rapide des explosifs utilisés. Dans ce contexte, les microsystèmes électrophorétiques sont très intéressants de par leur petite taille et leur géométrie adaptable permettant une analyse rapide sur le terrain. Cet article présente donc l état de l art des microsystèmes électrophorétiques utilisant différents modes de séparation et de détection pour l analyse d explosifs organiques ou inorganiques et leurs résidus. MOTS-CLÉS Explosifs, microsystèmes électrophorétiques. Analysis of explosives by electrophoresis microsystems SUMMARY Since twenty years, the permanent terrorist threat against, more particularly, western countries increased. An important amount of work was carried out in order to improve the rescue reactivity confronted to a blast. This reactivity requires a fast determination of the explosive natures. With their movable formats, microchips electrophoresis offer interesting possibilities. A direct use of these microchips on the bombing fi eld allowed sparing a considerable amount of time. This review presents the state of the art of the different applications carried out with electrophoresis microsystems for the analysis of organic - and inorganic - based explosives and their residues KEYWORDS Explosives, electrophoresis microsystems Securité Abréviations des explosifs organiques nitrés: 2-Am-4,6-DNT, 2-amino-4,6-dinitrotoluène; 4-Am-2,6-DNT, 4-amino-2,6-dinitrotoluène; 1,3-DNB, 1,3-dinitrobenzène; 2,4-DNP, 2,4- dinitrophénol; 2,3-DNT, 2,3-dinitrotoluène; 2,4-DNT, 2,4-dinitrotoluène; 2,6-DNT, 2,6-dinitrotoluène; HMX, octahydro-1,3,5,7-tétranitro-1,3,5,7- tétrazocine; NB, nitrobenzène; 3-NT, 3-nitrotoluène; RDX, hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine; Tetryl, méthyl-2,4,6-trinitrophénylnitramine; TNB, trinitrobenzène; TNT, 2,4,6-trinitrotoluène. I - Introduction La menace terroriste de plus en plus importante qui pèse sur les pays occidentaux contraint les autorités de ces mêmes pays à mettre en place des stratégies rapides et efficaces afin de prévenir la population contre tous risques d attentats ou dans les cas extrêmes à être très réactive après une explosion. Il existe donc une demande importante pour la détermination d explosifs après attentat. Plusieurs techniques analytiques peuvent répondre à cette problématique, comme la chromatographie en phase liquide (1) pour les composés organiques et la chromatographie d échange d ions (2) pour les composés inorganiques. Depuis 1991, l électrophorèse capillaire apparaît également comme une technique de choix pour l analyse aussi bien des composés organiques qu inorganiques (3-5). Mais de plus en plus, afin d accroître encore la réactivité, une technique d analyse rapide utilisable directement sur le lieu de l explosion est requise. Afin de répondre à cette demande, les techniques séparatives électrophorétiques, qui sont de nature miniaturisées, peuvent alors être mises en œuvre soit en format capillaire sur des systèmes portables (6) soit dans des microsystèmes (7). Les microsystèmes électrophorétiques ont connu, ces dernières années, un intérêt grandissant. Grâce à leur haut degré d intégration, leur portabilité, leur faible consommation de solvants et de réactifs et leur rapidité d analyse, ils permettent des 1 Laboratoire Central de la Préfecture de Police, 39 bis, rue de Dantzig, Paris. 2 Chimie ParisTech, Laboratoire Physicochimie des Électrolytes, Colloïdes et Sciences Analytiques (PECSA), Paris Cedex CNRS UMR UPMC Univ. Paris 06 *Correspondance : Nathalie Delaunay, PECSA, Chimie ParisTech, 11 rue Pierre et Marie Curie, Paris Cedex SPECTRA ANALYSE n 290 Janvier - Février - Mars 2013 Sciences analytiques Analyses d explosifs par microsystèmes électrophorétiques économies de temps et d argent importantes (8-10). Ces analyses sur microsystème laissent entrevoir un large champ d applications dans le domaine pharmaceutique et biomédical, mais aussi pour des analyses environnementales et médico-légales, notamment pour la recherche d explosifs (7). Ainsi de nombreuses études ont déjà été réalisées pour l analyse de composés explosifs ou de leurs résidus avec des microsystèmes. Cet article a pour but d en faire l état de l art. Les protocoles d analyse d explosifs sur microsystèmes sont d abord toujours développés au format capillaire, plus simple à mettre en œuvre et tout aussi miniaturisé que le format microsystème, puis transférés au microsystème. Ainsi, la plupart des publications faisant état de l analyse d explosifs sur microsystèmes électrophorétiques aborde les difficultés rencontrées lors du transfert de la méthode du format capillaire au format microsystème ou les modifications techniques apportées au microsystème, telles que son couplage avec la détection, la miniaturisation du détecteur ou l amélioration de l introduction d échantillons macroscopiques dans le microsystème sans intervention manuelle. II- Généralités sur les microsystèmes Un microsystème séparatif est un ensemble de quelques cm² résultant de l assemblage de deux éléments : une plaque inférieure contenant un réseau de canaux dont les dimensions sont de quelques dizaines de micromètres de côtés et une plaque supérieure comportement des orifices jouant le rôle de réservoirs et/ou permettant l interfaçage du réseau de canaux avec le milieu extérieur. Les microsystèmes utilisés pour l analyse d explosifs sont principalement réalisés en verre et munis d un système d injection avec une géométrie en croix. Certains auteurs ont également évalué un système d injection en forme de double-t dans le but d augmenter le volume injecté (11). Un nouveau type de microsystème composé d une interface d introduction d échantillons simple et efficace a été décrite et ses performances ont été démontrées avec une analyse par Chromatographie Electro Cinétique Micellaire () de trois explosifs organiques (TNT, TNB et 2,4-DNT) (12). L idée consistait en la fabrication d un microsystème muni d une extrémité pointue qui peut directement s introduire dans un flacon contenant l échantillon, afin de l analyser, ou dans un flacon contenant de l électrolyte pour l étape de séparation (voir Figure 1-1). Cette géométrie Figure 1 Représentation schématique du microsystème électrophorétique équipé de pointe(s) pour (1) simplifier l introduction de l échantillon et (2) réaliser des analyses en continu. (1) Le canal de séparation (c) est relié à l entrée de la pointe (e) et à la cellule de détection (i). L échantillon ou l électrolyte de séparation est introduit dans le canal de séparation en plaçant le réservoir d échantillon (f ) ou d électrolyte (g) à l extrémité de la pointe. La cellule de détection (i) comprend une électrode de platine reliée à la masse (a), une électrode de travail imprimée avec du carbone (h), une électrode auxiliaire de platine (j) et une électrode de référence Ag/AgCl (k). Une électrode de platine (d) sert de contact pour fournir la tension de séparation. D après (12). (2) Le canal de séparation (a) est relié aux pointes permettant l introduction de l échantillon (b) et de l électrolyte (c), à un réservoir non-utilisé (d) et à la cellule de détection (e). L échantillon est introduit à l aide d une pompe péristaltique (P) par un tube (f1) jusque dans le canal de séparation. L échantillon est ensuite évacué par le tube (g). L électrolyte est introduit par capillarité dans un tube en plastique (f2). La cellule de détection (i) comprend une électrode de platine reliée à la masse (h), une électrode de travail imprimée avec du carbone (i), une électrode auxiliaire de platine (k) et une électrode de référence Ag/AgCl (j). Deux électrodes sont insérées dans les tubes plastiques (f1,f2), respectivement, et servent de contacts électriques pour fournir la tension de séparation. D après (13). SPECTRA ANALYSE n 290 Janvier - Février - Mars évite ainsi à l utilisateur de remplir et rincer les réservoirs présents sur le microsystème. Ceci a permis d analyser de manière simple et répétable des échantillons sans effet mémoire. Cette introduction alternative de l échantillon et de l électrolyte peut être évitée par la mise en place d une seconde pointe comme présentée sur la Figure 1-2 (13). Avec un débit d échantillon compris entre 0,2 et 1,8 ml min -1, une séquence de 40 analyses consécutives a été réalisée en 125 min avec des écart-types sur les réponses et les temps de migration inférieurs à 4 %. III- Explosifs inorganiques L analyse d explosifs inorganiques par microsystèmes électrophorétiques est beaucoup moins décrite dans la littérature que l analyse d explosifs organiques (14-19) (voir Tableau 1), néanmoins plusieurs études ont été publiées. De manière générale, une séparation en électrophorèse de zone associée à une détection conductimétrique, facilement miniaturisable et intégrable, a été le plus souvent mise en œuvre pour l analyse d ions caractéristiques d explosifs inorganiques sur microsystèmes. L isotachophorèse a aussi été utilisée (20). Cette technique a permis l analyse des anions chlorure, chlorate et perchlorate avec l anion nitrate comme ion meneur en présence d α-cyclodextrine et l ion cyanoacétate comme ion terminal. Une approche originale utilisant un détecteur conductimétrique sans contact (CCD) miniaturisé a été décrite par Pumera et coll. (14). Elle permet la détection directe des ions, empêche la passivation des électrodes grâce à l absence de contact entre ces dernières et les solutions, et offre une isolation presque parfaite du système de détection par rapport aux importants champs électriques de séparation. Les efficacités de séparation sont ainsi conservées et la fabrication simplifiée. Deux électrodes consistant en de fins films d aluminium de forme rectangulaire sont donc fixées sur la face externe du microsystème à une distance plus ou moins importante de la sortie du capillaire et l impédance de la solution dans le canal de séparation est ensuite mesurée. Ceci a été appliqué à l analyse d anions et de cations inorganiques caractéristiques potentiellement présents dans des résidus d explosion (15). Le faible écoulement électroosmotique (EOF) créé par le polyméthylméthacrylate, matériau constitutif du microsystème, a facilité le basculement rapide d une analyse de cations vers une analyse d anions dans le même canal de séparation et sans inverseur d EOF, en inversant simplement la polarité de la tension appliquée. L approche CCD a par la suite été améliorée avec l arrivée d un détecteur pouvant se déplacer le long du canal de séparation (16), ce qui permet à la fois une meilleure compréhension du processus de séparation, en voyant évoluer les résolutions par exemple, et peut aussi aider à l optimisation de la longueur du canal, de la tension de séparation et donc par conséquent du temps d analyse. Le système est alors capable de passer d une analyse globale (échantillonnage) à une analyse composé par composé juste en plaçant le détecteur plutôt vers l entrée ou la sortie du canal. Ces améliorations apportées par le détecteur mobile ont été illustrées avec l analyse simultanée de six anions et cations présents dans des résidus post-explosion (17). Deux injections électrocinétiques ont été simultanément réalisées grâce à la présence d une croix d injection à chaque extrémité du canal de séparation. Comme l EOF est faible, les anions et les cations migrent dans des directions opposées lorsque le champ électrique est appliqué et sont détectés par le CCD placé au centre du canal de séparation. Plus récemment, Wang et coll. ont rapporté pour la première fois l utilisation d un CCD «hybride» placé en sortie de canal qui permet aussi une détection ampérométrique (18). Un gain d un facteur 10 est obtenu sur la sensibilité de 3 cations (ammonium, méthylammonium et sodium) avec cette géométrie, comparée à une géométrie conventionnelle tout en améliorant la forme des pics obtenus. Cette approche permet d intégrer au microsystème une détection ampérométrique et conductimétrique, permettant une analyse sensible et simultanée d explosifs organiques et inorganiques, laquelle sera plus longuement décrite plus loin. En conclusion, il existe encore des améliorations à apporter aux étapes de détection pour l analyse de composés inorganiques sur microsystèmes ainsi que sur l étape d injection pour faciliter le passage de l échelle macroscopique à l échelle microscopique. IV - Explosifs organiques Les explosifs organiques sont des composés neutres qui ne peuvent pas être séparés par électrophorèse de zone. En revanche, ils peuvent l être par ou par Electro Chromatographie (CEC). Concernant les analyses par d explosifs organiques en microsystèmes électrophorétiques, aucun nouveau développement d électrolyte n a été présenté. La plupart des auteurs ont utilisé un tampon borate classique contenant du SDS 15 ou 20 mm. Si les séparations en au format capillaire sont facilement transférables au format microsystème, cela parait nettement plus complexe pour les séparations en CEC, pour lesquelles une phase stationnaire est requise que cela soit dans un but de préconcentration et/ou de séparation. Comme il est difficile d introduire et de compacter de manière reproductible des petites particules sphériques de phase stationnaire dans le canal d un microsystème, l approche d une synthèse insitu d une phase monolithique est très souvent privilégiée. Ainsi, une phase stationnaire apolaire a été directement synthétisée selon un processus sol-gel par Giordano et coll. dans le canal de séparation en utilisant des précurseurs à base de 36 SPECTRA ANALYSE n 290 Janvier - Février - Mars 2013 Sciences analytiques Analyses d explosifs par microsystèmes électrophorétiques Tableau I Analytes, électrolytes, modes de séparation et de détection, limites de détection et temps d analyse illustrant l analyse d explosifs inorganiques et organiques dans des microsystèmes électrophorétiques. a LOD : limite de détection ; bréf : référence ; c : Electrophorèse capillaire de zone ; d MES : acide morpholinoéthanesulfonique ; e CCD : Détection conductimétrique sans contact ; f SDS : Dodécylsulfate de sodium ; g IDLIF : Détection indirecte par fluorescence induite par Laser ; h : Chromatographie ElectroCinétique Micellaire ; i ACN : acétonitrile ; j MeOH: méthanol ; k UV dir. : détection UV directe ; l SPE : Extraction sur Phase Solide ; m LIF : Détection de fluorescence induite par Laser ; n CEC : ElectroChromatographie Capillaire ; o TETT : Acide N-(triméthoxysilylpropyl) éthylènediamine triacétique ; p NR : Non Renseigné ; q CD : cyclodextrine ; r : détection électrochimique ; s MMA : méthylammonium. Analytes Mode de séparation Électrolyte Détection LODa (ppb) tanalyse (s) Réf.b Composés inorganiques K +, Na +, Ba 2+, Li + ; Cl -, SO 4 2-, F-, CH 3 COO -, PO 4 3- c MES d 20 mm, CCD e (14) K +, NH 4+, Na +, MMA s ; NO 3-, Cl -, ClO 4 - K +, NH 4+, Na +, MMA; NO 3-, Cl -, ClO 4 - NH 4+, Na +, MMA, NO 3-, Cl -, ClO 4 - (simultanée) MES 20 mm, 18-C-6 7,5 mm, MES 20 mm, MES 20 mm, CCD (15) CCD NR p 60 (16) CCD (17) Cl -, ClO 3-, ClO 4 - ITP Meneur : HNO 3 1,75 mm, InNO 3 2,75 mm, α- CD q 9 mm Terminal : Acide cyanoacétique 20 mm Conductimétrique (20) Composés organiques TNT, 2,4-DNT, 2,6-DNT, 4-NT, DNB h SDS f 25 mm, ph 8,7 r (27) TNT, RDX, 2,4-DNT, 2,6-DNT, 2,3-DNT Borate 15 mm SDS 25 mm, ph 8,7 (Au) (33) TNT, DNB, TNB, NB, Tetryl, 2,4- DNT, NT, 2,6-DNT, HMX, RDX, 2-Am-4,6-DNT, 4-Am-2,6-DNT Borate 50 mm, SDS 50 mm, Cy7 5 μm, ph 8,5 IDLIF g (11) TNT, 2,4-DNT, 2,6-DNT, 2,3-DNT SDS 25 mm ou MES 25 mm, ph 8,7 (Au) (32) TNT, TNB, DNB, 2,4-DNT, 2-Am-4,6-DNT, 4-Am-2,6-DNT SDS 20 mm, (28) TNT, TNB, Tetryl NACE r MeOH j 12,5%, NaOH 2,5 mm, ACN i 87,5%, SDS 1 mm UV dir k. 505 nm sans SPE l 0,19-0,34 avec SPE 20 (25) SPECTRA ANALYSE n 290 Janvier - Février - Mars TNT, 1,3-DNB, 2,4-DNT SDS 15mM, (diamant) (30) TNT, DNT, TNB SDS 15 mm, (12) TNT, TNB, DNB SDS 15 mm, NR 170 (13) TNT (Hg/Au, carbone, Au) 7 24 (31) TNT Borate 10 mm, ph 10, NR (29) NB, 2,4-DNT, TNT, 3-NT SDS 15 mm, (34) TNT, TNB, 2,4-DNT, 1,3-DNB, 2,4-DNP Immuno-essai Tampon phosphate, ph 7,6 LIF m 1 50 (23) TNT Immuno- essai Tampon acétate, tris, EDTA, ph 8,2 LIF 1 55 (24) 1,3,5-TNB, 2,4-DNT, 3-NT, RDX, 1,3-DNB, TNT CEC n Tris 20 mm, ACN 40%, ph 10 UV dir. 254 nm NR 150 (21) TNT, DNB CEC- Sol-gel Phosphate 40 mm, MeOH 13%, TETT o 175 mm, ph 10, (22) Composés organiques et inorganiques MMA, NH 4+, Na + TNB, TNT, 2,4-DNB, 2-Am-4,6-DNT / MES 20 mm, LiDS 15 mm, CCD (18) méthyltriméthoxysilane (21). Afin de compenser les différences de longueurs de séparation que l on a entre le format capillaire et le format microsystème, entraînant par conséquent des différences de résolution, les auteurs ont augmenté le caractère hydrophobe de la phase stationnaire. C est pour cette raison qu ils ont synthétisé des gels hybrides à base de précurseurs méthyl- et éthyltriméthoxysilane. Il est enfin à noter que les auteurs ont remplacé la traditionnelle croix d injection pour privilégier une configuration en Y. En effet comme un phénomène de préconcentration est mis en œuvre à l entrée de la phase stationnaire, le réservoir servant de poubelle pour l échantillon est le même que celui qui contient l électrolyte de séparation à la sortie du canal. On limite donc le nombre de réservoirs et par conséquent d électrodes, et l on facilite donc la programmation du générateur de tension multi-voies. Pour la première fois dans le cas des microsystèmes, Pumera et coll. ont ajouté à l électrolyte un sol anionique organiquement modifié (Ormosil) jouant le rôle de pseudo-phase stationnaire permettant d améliorer la sélectivité : les mobilités des analytes étaient modifiées en fonction de leur interaction avec le sol (22). L ajout de ce sol anionique de silice à un tampon phosphate a ainsi permis la séparation du TNT et du DNB. De plus, il est à noter que la présence de sol dans l électrolyte n a altéré en rien la détection des composés : la reproductibilité de la réponse et la linéarité ont été vérifiées. Enfin, les sols sont utilisables en très faible quantité et sans perte d efficacité plus de six mois après leur synthèse, ce qui les distingue des phases micellaires qui ont une durée de vie limitée. Les microsystèmes ont aussi été utilisés pour réaliser des immunoessais du TNT en mode direct, compétitif, de déplacement ou sandwich, en immobilisant des anticorps anti-tnt sur la surface du canal de séparation (23). Les microsystèmes 38 SPECTRA ANALYSE n 290 Janvier - Février - Mars 2013 Sciences analytiques Analyses d explosifs par microsystèmes électrophorétiques pour des immunoessais ont pour avantages d avoir (i) un temps d analyse très réduit car les dimensions selon lesquelles les analytes doivent diffuser sont réduites et (ii) une augmentation du rapport surface sur volume. Des déterminations très sensibles du TNT ont été réalisées avec des limites de détection comprises entre 1 et 20 μg L -1 selon les modes utilisés. Une autre étude a étendu cette application aux molécules analogues du TNT pour la mesure des constantes de complexation et de dissociation (24). Un microsystème radial, présenté par Bromberg et coll., a permis l analyse simultanée par immunoessai de 96 échantillons contenant du TNT (25). Tout comme en électrophorèse capillaire (EC), la détection UV peut être utilisée sur microsystèmes. Cela a été réalisé en couplant une lampe deutérium à une fibre optique arrivant au niveau du canal de séparation et un objectif de microscope à transmission UV capable de collecter la lumière à 254 nm (21). Le chemin optique a été augmenté à 100 μm en gravant sur une plus grande profondeur de maniè
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