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MODELOS DE DIFUSÃO DE UM VÍRUS NO CITOPLASMA: MODELO FRACIONÁRIO E COM SUPER-ESTATÍSTICA Diffusion models of a virus in cytoplasm: Fractional model e with superstatistics

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Resumo: Este texto discute tanto o movimento estocástico de um vírus livre no citoplasma de uma célula viva, quanto o movimento anômalo na forma contida no endossoma. É discutida uma teoria de cinética fracionária generalizada para o caminho da
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  MODELOS DE DIFUSÃO DE UM VÍRUS NO CITOPLASMA: MODELO FRACIONÁRIO E COM SUPER-ESTATÍSTICA Diffusion models of a virus in cytoplasm: Fractional model e with superstatistics Paulo Roberto Ferrari Mosca# #- Médico, pediatra, doutor, professor do Departamento de Pediatria e Puericultura, Faculdade de Medicina, UFRGS; HCPA Resumo: Este texto discute tanto o movimento estocástico de um vírus livre no citoplasma de uma célula viva, quanto o movimento anômalo na forma contida no endossoma. É discutida uma teoria de cinética fracionária generalizada para o caminho da infecção do vírus no citoplasma, bem uma outra que agrega super-estatística para a descrição de sistemas complexos em não equilíbrio. Abstract: This text discusses both the stochastic movement of a free virus in the cytoplasm of a living cell and the anomalous movement in the form contained in the endosome. A generalized fractional kinetic theory for the pathway of virus infection in the cytoplasm is discussed, as well as another one that aggregates super-statistics for the description of complex systems in non-equilibrium. INTRODUÇÃO A maior parte dos vírus que ingressam nas células após a ligação a receptores de membrana específicos 1,2  estão envolvidos num compartimento endossomal. Para sofrer a replicação citoplásmica ou nuclear e para evitar a degradação em ácidos lisossômicos, os vírus devem então escapar com sucesso do endossoma, pois o movimento estocástico do vírus pode ser terminado pela morte na rota infecciosa. Os vírus envelopados, como o influenza, contêm glicoproteínas associadas à membrana, que medeiam a fusão entre a membrana viral e a endossomal. Em particular, a acidificação do endossoma desencadeia a alteração conformacional das hemaglutininas do vírus influenza para um estado fusogênico, levando à fusão de membranas de endossomas e à liberação de genes no citoplasma. Outros vírus não envelopados, como o vírus adeno-associado, têm que escapar do endossoma, um processo que requer uma das (menos de 10) proteínas da cápside para mudar a conformação. Após a fuga endossomal, os vírus têm que viajar através do citoplasma, que é um meio abarrotado, para atingir o núcleo e entregar seu material genético através dos poros nucleares. Enquanto o movimento citoplasmático das partículas virais em direção ao núcleo é facilitado pelas proteínas do virus e da rede microtubular, muito pouco se sabe sobre o destino de vetores não virais de DNA no citoplasma. Contudo, o aprisionamento de grandes partículas de DNA (com mais de 500 kDa) no citoplasma abarrotado dificulta drasticamente a sua difusão citoplasmática 3,4  e subsequentemente diminui a velocidade de transfecção de vetores gênicos sintéticos. Alguns modelos matemáticos e físicos deste processo foram construídos com a finalidade de quantificar a infecciosidade e o sucesso da liberação de genes. Em geral, os modelos dão srcem a simulações de dinâmica browniana para o estudo da sensibilidade a parâmetros e, eventualmente, para testar o aumento ou a queda da infecciosidade, utilizando simultaneamente uma combinação de várias drogas. Esta abordagem de modelagem pode ser utilizada para a otimização do espaço de parâmetros de alta dimensão. Por exemplo, os peptídeos fusogênicos, derivados de glicoproteínas virais, são cada vez mais utilizados como vetores sintéticos catiônicos e a sensibilidade  ao pH de glicoproteínas fusogênicas pode agora ser modificada, mudando-se a estabilidade eletrostática do complexo fusogênico. Essas glicoproteínas, frutos da engenharia genética, destinam-se à concepção de vetores génicos eficazes, pelo que modelos quantitativos possam otimizar as propriedades moleculares da glicoproteína em relação à eficácia de escape endossomal do vetor. Os movimentos das vesículas citoplasmáticas e dos vírus alternam intermitentemente entre períodos de livre difusão e movimentos direcionados ao longo dos microtúbulos. Essas trajetórias virais foram monitoradas recentemente através de novas técnicas de imagem in vivo. Numa abordagem simples, a trajetória de uma partícula viral  x (t)  pode ser modelada como um processo de comutação aleatória onde dx(t) = √(2D) dw  para  x(t)  livre e dx(t) = V dt   para  x(t)  ligado ao microtúbulo, onde  w(t)  é o movimento browniano padrão,  D  é a constante de difusão e V(x)  é a velocidade de campo do movimento dirigido ao longo dos microtúbulos 5 . Com isto, este movimento costuma ser grosseiramente descrito pela equação estocástica dx = b(x) dt +   √(2D) dw , onde b(x)  é uma derivação que contabiliza os períodos balísticos ao longo dos microtúbulos. Esta dinâmica estocástica pode ser usada para gerar simulações em computador de trajetórias, livres e confinadas, num meio ambiente 6,7 . Ela também pode ser usada para derivar fórmulas assintóticas para a probabilidade do tempo médio de primeira passagem do vírus para um poro do núcleo 8 . Várias análises de expressões para a derivação efetiva foram feitas para várias geometrias, na medida em que a expressão para b(x)  depende da organização do microtúbulo e das propriedades dinâmicas virais, tais como a constante de difusão  D , a afinidade com os microtúbulos e a velocidade líquida ao longo dos microtúbulos. Alguns modelos matemáticos e físicos simples foram já propostos 9-12 . A otimização da entrega do vírus num espaço de parâmetro com muitas dimensões já foi discutida 9 , bem como os vetores sintéticos 13-15  e os movimentos de vírus e de vesículas que alternam intermitentemente entre períodos de difusão livre e movimento dirigido ao longo de microtúbulos 2 . Tais trajetórias virais foram recentemente monitorizadas através de novas técnicas de imagem in vivo 16,17 . Um modelo para estimar o tempo de residência de uma partícula viral dentro de um compartimento endossomal foi considerado 9 . A modelagem em duas etapas na produção de vírus foi revisada 12 . SOBRE ALGUNS VÍRUS Um dos aspectos menos compreendidos hoje da morfogênese viral é a dinâmica do transporte de partículas virais. Estes eventos dinâmicos são estudados melhor por partículas de vírus marcadas fluorescentemente em combinação com microscopia de fluorescência de células vivas. Nos últimos anos, os vírus recombinantes que expressam fusões de proteínas estruturais com proteínas fluorescentes alargaram amplamente a compreensão sobre os processos dinâmicos envolvidos na morfogénese de um grande número de diferentes vírus 18-28 . Isto levou à construção de modelos mais complexos. O citomegalovírus  é um herpes vírus que replica no núcleo da célula 29 . Este aspecto da estratégia de replicação do herpes vírus implica a necessidade de vários movimentos de partículas durante o ciclo replicativo, em particular a translocação de partículas de vírus penetradas do córtex celular para o núcleo, a saída de partículas de vírus recentemente sintetizadas para fora do núcleo e a translocação de partículas, sendo que a progênie do vírus deve ir para a periferia da célula a fim de liberar o vírus infeccioso às células circunvizinhas. Contudo o estudo da entrada e da morfogênese dos herpes vírus tipo beta pelo método do rastreamento de partículas é atualmente limitado, devido à falta de vírus competentes com fluorescência marcada com cápside 30 . Para  vencer estas dificuldades operacionais, foram investigados murino-citomegalovírus recombinantes viáveis, mas com inserções ectópicas de proteína de pequena cápside fundidas com proteínas fluorescentes. Estas proteínas fluorescentes foram inseridas numa posição interna que permitiu a produção de citomegalovírus viáveis, fluorescentemente marcados, que replicaram com cinética de tipo selvagem, em cultura celular 31 . As partículas fluorescentes foram prontamente detectáveis por vários métodos. Além disso, num ensaio de espalhamento, foram encontradas cápsides marcadas acumuladas em torno do núcleo das células recém-infectadas sem qualquer expressão de gene viral detectável, o que sugeriu entrada normal e tráfico de partículas. Estes recombinantes foram utilizados para registar a dinâmica das partículas através de microscopia de células vivas durante a saída do murinocitomegalovírus, com elevada resolução espacial e temporal. A partir das trilhas resultantes, foram obtidas as velocidades de vias médias, e também seus deslocamentos médios quadráticos e os coeficientes de difusão. Com esta informação chave, foi possível descrever o comportamento das partículas com alto detalhe e discriminar entre as faixas de partículas que exibem movimento direcionado e as faixas nas quais as partículas exibiam ou difusão livre o deslocamento quadrático médio  MSD  tem uma relação linear com o tempo) ou difusão anômala (MSD tem relação não linear com o tempo, sendo usualmente descrita por uma lei de potência tipo  εSD α Dt  α ) 32 . Os padrões de fluorescência de partículas únicas de vírus obtidos foram ajustados por uma função gaussiana bidimensional; para cada trajetória, foi calculado um conjunto de valores para o deslocamento quadrático, r  2  (t) , entre duas observações separadas pelo intervalo de tempo t  lag   = n • Δt   (onde  Δt   é o intervalo de tempo entre quadros sucessivos dos filmes, n = 0, 1, 2, ..., N-1  sendo  N   o número total de pontos em uma trajetória). Os deslocamentos quadráticos médios (  MSD = <r  2  (t)> , onde < . >  denota média) foram então plotados para cada tempo de atraso e as parcelas do MSD foram ajustadas para os 10 primeiros tempos de atraso (10 pontos), assumindo três modos diferentes de movimento possível: - difusão normal:  MSD = 4Dt  , - difusão anômala:  εSD = 4Dtα , - difusão com movimento direto:  MSD = 4Dt + (vt) 2 , onde  D  é o coeficiente de difusão, α  o expoente anômalo e v  é a velocidade do transporte direcionado 31 . Para determinar para cada trajetória única qual modo de movimento descrevia melhor os dados, cada gráfico MSD foi ajustado pelas equações acima e o chi-quadrado reduzido dos ajustes foi comparado. O modelo de difusão normal foi usado enquanto as funções mais complexas do modelo para difusão anômala e para movimento dirigido com difusão não resultaram em pelo menos duas vezes a redução do chi-quadrado do ajuste. Nos casos em que essa condição foi preenchida, o modo de movimento com o chi-quadrado mínimo foi escolhido. Portanto, este procedimento leva ao agrupamento de partículas difusoras em três classes distintas representando diferentes modos de difusão 31 . A esse respeito, o rastreamento de partículas virais extracelulares fornece um ambiente com baixa densidade de fundo e baixa densidade de partículas e é ideal para estabelecer um fluxo de trabalho de rastreamento. Mas a entrada do vírus na célula em geral pode também ser seguida, pelo menos com vírus não envelopados, se houver vírions quimicamente etiquetados 33 . A enorme vantagem de um vírus codificando geneticamente marcadores fluorescentes é a possibilidade de seguir o destino das partículas virais intracelulares recentemente produzidas. No entanto, o movimento de partículas no citoplasma durante a saída do vírus ocorre num ambiente caracterizado por  alto ruído de fundo, com contagens elevadas de partículas e comportando uma secção transversal reduzida da célula, devido ao arredondamento das células induzido pelo vírus. Já em 1997, Saxton e Jacobson rastrearam partículas logo após aparecerem primeiro no citoplasma e seguiram sua motilidade; como controle negativo foram utilizadas células infectadas tratadas com o fármaco despolimerizante de microtúbulos Nocodazol 34 . Modernamente, usando uma aproximação sofisticada de encaixe, foram aglomeradas as trilhas obtidas de partículas virais em quatro classes que representam partículas imóveis e as partículas móveis que exibem a difusão anômala, ou a difusão livre ou o movimento dirigido. Foi descoberto que o tratamento com Nocodazole reduziu drasticamente a fração de partículas móveis de aproximadamente 88% para 15%. Este efeito foi principalmente devido à redução de partículas que exibem movimento dirigido (79% a 6%), enquanto que a proporção de partículas que exibem difusão livre ou anômala não mudou fortemente. Isto mostrou, como foi referido antes que o transporte citoplasmático do vírus é principalmente mediado por microtúbulos. Contudo, foi surpreendente que a dissociação dos microtúbulos pelo Nocodazole não aumentasse muito a proporção de partículas difusoras livres ou anómalas (4,4% a 6,8% e 5,2% a 2,5%, respectivamente). Esse achado pode indicar que as partículas ainda estão ligadas a fragmentos de microtúbulos após o tratamento com Nocodazole, já que os dados de rastreamento indicaram uma proporção muito grande de partículas que não se moveram mais do que a precisão de localização de 30 nm (classificada como imobilizada). Contudo, outros mecanismos para a imobilização de cápsides são também possíveis, tais como o aprisionamento numa gaiola molecular ou a fixação a uma âncora molecular. Além disso, foi observada uma distribuição muito ampla de  D . Assumindo uma viscosidade citoplasmática uniforme, este achado traduzir-se-ia numa distribuição não uniforme dos tamanhos de vesículas utilizados pelo vírus para transportar partículas. Uma explicação simples para a distribuição mais ampla de  D  poderia ser que ela reflita as diferenças de tamanho entre cápsides envelopados e nuas. Além disso, foi observada uma grande diferença no tamanho das vesículas para vesículas contendo vírus na microscopia eletrônica de transmissão. A soma dessas interpretações pode se traduzir no fenótipo observado, demonstrando o poder do rastreamento de uma única partícula para sondar o ambiente das partículas medidas, sem a necessidade de co-rotulagem extensiva 31 . O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é um lentivírus, um subgupo dos retrovírus. O virião HIV entra em macrófagos e células T CD4 + pela adsorção de glicoproteínas na sua superfície a receptores na célula alvo, seguindo-se a fusão do envelope viral com a membrana celular e a libertação da cápside de HIV na célula. O RNA do HIV e várias enzimas, incluindo a transcriptase reversa, a integrase, a ribonuclease e a protease, são injetados na célula. Durante o transporte, baseado no microtúbulo, ao núcleo, o genoma viral de RNA de cadeia simples é transcrito em DNA de cadeia dupla, que é então integrado num cromossoma hospedeiro 35,36 . O mecanismo fisiológico pelo qual o HIV-1  é transportado no citoplasma permanece indefinido; este transporte é complicado quando a proteína de antígeno grupo-específico (Gag) é expressa, porque uma porção significativa de HIV-1 RNA pode ser transportada como complexos Gag-RNA  –   o que traz diferenças nas propriedades monitoradas, através do uso de rastreamento do movimento de moléculas isoladas. Foi observado que a maioria das moléculas de HVI-1 RNA se movem num modo não direcional e com andar randômico (o que não requer uma estrutura intacta do citoesqueleto) e que a MSD do RNA aumenta linearmente com o tempo, indicando difusão normal. Mas uma molécula de HIV-1 RNA isolada pode se mover em várias velocidades através do citoplasma,  indicando que seu movimento é fortemente influenciado pelo meio imediato. Além disso, como o movimento deste vírus não é direcional, foi calculado que o tempo requerido para o vírus ir da membrana citoplasmática externa até o núcleo pode levar até ~20 minutos 37 . MODELO FRACIONÁRIO O vírus adeno-associado é um pequeno vírus que infecta seres humanos e algumas outras espécies de primatas, não sendo atualmente conhecido por causar doença. O vírus provoca uma resposta imune muito suave, dando mais apoio à sua aparente falta de patogenicidade. Os vectores de terapia génica que utilizam o vírus adeno-associado podem infectar células em divisão e quiescentes, e persistem num estado extra cromossômico sem integração no genoma da célula hospedeira, embora no vírus nativo ocorra alguma integração de genes transportados por via viral no genoma do hospedeiro 38 . Estas características tornam o vírus adeno-associado um candidato muito atraente para a criação de vetores virais para terapia genética e para a criação de modelos isogênicos de doenças humanas 39 . O caminho infeccioso do vírus adeno-associado em células vivas tipo HeLa foi estudado experimentalmente, através da técnica de imagem de molécula isolada em tempo real. Aqui uma solução com vírus em baixa concentração foi adicionada a um meio de cultura de células vivas, e foram analisadas as trajetórias dos vírus, cada uma quais etiquetada com molécula de corante fluorescente, no citoplasma 16,40 . Estes experimentos mostraram que os vírus fluorescentes exibiram movimentos estocásticos numa forma livre e também numa forma contida no endossoma. Deve ser notado que o acompanhamento de vírus isolados afasta a noção de média do conjunto das partículas. As trajetórias de difusão estudadas, com alta resolução espacial e temporal, mostraram vários modos de movimento de vírus adeno-associados durante sua via de infecção em células vivas HeLa, tais como: - (i) vírus consecutivos tocando na superfície celular e endocitose rápida; - (ii) difusão livre e difusão anômala do endossoma e do vírus no citoplasma e no núcleo; e - (iii) movimento direcionado por proteínas motoras no citoplasma e em estruturas tubulares nucleares. O MSD num movimento estocástico é <x 2 > ~ t  α , (1) para um tempo longo, em geral. A difusão normal comporta α = 1 , sendo que 0 < α < 1  corresponde à subdifusão e α > 1  corresponde à superdifusão. O experimento com vírus adeno-associado mostra que o MSD do vírus fluorescente exibe não só difusão normal, mas também subdifusão. O que é notável é que, no caso da subdifusão, α  flutua entre 0,5 e 0,9, dependendo da área localizada no citoplasma 40 , manifestando a estrutura heterogênea do citoplasma que serve como um meio para o movimento estocástico do vírus. Este fenômeno da flutuação de α  está em marcado contraste com a difusão anômala tradicional, onde α  tem um só valor 41-43 . Estes modelos tradicionais de difusão anômala são discutidos para vários sistemas físicos, como movimento de partícula em fluxo turbulento, transporte por carregador de carga em sólido amorfo, fluxo de vórtex contaminado em fluído, dinâmica caótica, vidros porosos, entre outros 44-49 . Um modelo 50 , baseado na teoria da difusão, foi desenvolvida para o caminho infeccioso do vírus adeno-associado no citoplasma de célula HeLa viva, com base em um fenômeno observado por imagem única molécula, levando em conta as flutuações de α . Neste modelo, o citoplasma desempenha o papel de um meio para o movimento
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