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Avaliação da atividade antiinflamatória crônica do extrato etanólico de Bouchea fluminensis – VERBENACEAE

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The use of natural resources in the treatment of different diseases has increased with intensity in the last years. Previous works accomplished with the botanical specimen Bouchea fluminensis, had shown the antiinflammatory potential in acute
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  364 ISSN0326-2383 PALAVRAS CHAVE:  Bouchea fluminensis, Granuloma, Inflamação, Produtos avançados de oxidação de proteí-nas. KEY WORDS: Advanced products of protein oxidation,  Bouchea fluminensis, Granuloma, Inflammation.*Author to whom correspondence should be addressed  E-mail: delaporte@unipar.br  Latin American Journal of Pharmacy (formerly  Acta Farmacéutica Bonaerense) Lat. Am. J. Pharm. 27 (3): 364-8 (2008) Original ArticleReceived: March 24, 2008Accepted: April 5, 2008 Avaliação da Atividade Antiinflamatória Crônicado Extrato Etanólico de  Bouchea fluminensis (Verbenaceae) Simone C. PUPO 1 ; Gema PÉREZ DAVISON 2 ; Gregorio MARTINEZ-SÁNCHEZ 2 ,Orlando S. TAKEMURA 3 ; Aristeu V. SILVA 1 ;Gentil F. GONÇALVES 1 & Rosemeres H. DELAPORTE 3 *. INTRODUÇÃO Desde os mais remotos tempos, o ser huma-no tem procurado na natureza tratamentos parasuas moléstias. A experiência mostrou que o rei-no vegetal é particularmente pródigo, onde mui-tas plantas são utilizadas empiricamente desdelonga data na medicina popular 1 . Atualmenteos fitoterápicos são amplamente utilizados emdiversos países. Em alguns países da África, 80%da população dependem do uso desses medica-mentos, que representam alternativas mais aces-síveis frente ao alto custo dos fármacos sintéti-cos 2 . Apesar da maioria dos medicamentos se-rem de srcem sintética, os fármacos provenien- 1  Departamento de Veterinária, Universidade Paranaense (UNIPAR),Praça Mascarenhas de Moraes, s/n CEP: 87.502-210 - Umuarama, Paraná, Brasil. 2  Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana.San Lázaro y L. CP.10400. Ciudad Habana. Cuba. 3  Instituto de Ciências Biológicas, Médicas e da Saúde, Universidade Paranaense (UNIPAR),Praça Mascarenhas de Moraes, s/n CEP: 87.502-210 - Umuarama, Paraná, Brasil. RESUMO. O emprego de recursos naturais no tratamento de distintas doenças tem ressurgido com inten-sidade nos últimos anos. Trabalhos anteriores realizados com a espécie vegetal  Bouchea fluminensis,  apon-tam seu potencial antiinflamatório em processos agudos. O presente trabalho avaliou o efeito do extratoetanólico em modelo de granuloma em ratos. Durante 7 dias, foram administrados por via oral 25, 50 e100 mg/kg de extrato etanólico de  B. fluminensis,  no grupo controle positivo indometacina 5 mg/kg. Após operíodo de tratamento, a formação dos granulomas foram avaliados, revelando que o granuloma nos ani-mais tratados com extrato nas concentrações de 50 e 100 mg/kg foram significativamente diminuídos. Adi-cionalmente, a determinação de produtos avançados da oxidação de proteínas mostrou que em todas asdoses testadas do extrato foram significativamente diferentes ao grupo controle (água). A relação doseefeito teve um coeficiente de correlação de 0,97. A concentração efetiva média para  B. fluminensis foi de47,26 mg/kg (Min. 40,04 mg/kg; Max. 54,49 mg/kg). A utilização deste marcador para avaliar os efeitos an-tiinflamatórios do extrato vegetal em modelo de granuloma em ratos se mostrou mais sensível do que ométodo gravimétrico. SUMMARY. “Antiinflammatory Activity of the  Bouchea fluminensis (Verbenaceae) Etanolic Extract”. The use of natural resources in the treatment of different diseases has increased with intensity in the last years. Previousworks accomplished with the botanical specimen  Bouchea fluminensis, had shown the antiinflammatory potentialin acute inflammatory processes. The present work evaluated the effect of the ethanolic extract in granuloma testin rats. For 7 days, 25, 50 or 100 mg/kg of ethanol extract of   B. fluminensis were administered orally in the con-trol positive group indometacina 5 mg/kg was used. After treatment, the granuloma formation was evaluated, re-vealing that the granuloma in the group of animals treated with plant extract in the concentrations of 50 and 100mg/kg were significantly decreased. Additionally, the determination of advanced products of proteins oxidationshowed that in all the tested doses of the extract were significantly different compared with the control group (p< 0.01). The relationship between the dose and effect had a coefficient of correlation of 0.97. The effective con-centration of   B. fluminensis extract was of 47.26 mg/kg (Min. 40.04 mg/kg; Max. 54.49 mg/kg). The use of thismarker to evaluate the antiinflammatory effects of the vegetable extract in granuloma model in rats was shown tobe more sensitive than traditional gravimetric method.  365  Latin American Journal of Pharmacy - 27 (3) - 2008 tes de plantas superiores ocupam um lugar im-portante na medicina moderna 3 . Os produtosnaturais podem ainda ser utilizados como protó-tipos para obtenção de fármacos com atividadesterapêuticas semelhantes a dos compostos srci-nais 4 . Bouchea fluminensis  é uma planta herbáceapertencente à família Verbenaceae, conhecidano Brasil como “gervão de folha grande” ou“falso gervão”. Popularmente, a espécie é utili-zada como estimulantes e reguladores do siste-ma digestivo e como agente antiinflamatório 5,6 .Estudos químicos prévios revelaram a presençade iridóides, como o lamiídeo, durantosídeo, verbascosídeo, boucheosídeo 6-9 . E, identifica-ram, o esteróide 3 β -O-glicopiranosídeo 8 e osácidos mirístico e palmítico 10 .Fenner et al. 11 relataram a atividade antifún-gica das folhas da espécie, citando o potencialuso no tratamento de úlceras de pele. A ativida-de antiinflamatória e analgésica do extrato eta-nólico de Bouchea fluminensis  foi comprovadapor Delaporte et al. 6,12 e por Costa 13 , respecti- vamente. Em modelos experimentais de edemade pata de rato, o lamiídeo mostrou potente ati- vidade, percebida também em ensaios de pero-xidação lipídica 6 . Assim sendo, este trabalho teve como objeti- vo avaliar a atividade antiinflamatória crônica doextrato etanólico de Bouchea fluminensis, coma realização dos ensaios de granuloma em ratos,e realização das provas bioquímicas com os ob-tidos. MATERIAIS E MÉTODOS  Material botânico e Preparo do extrato  As folhas de Bouchea fluminensis  foram co-letadas no Horto de plantas medicinais da Uni- versidade Paranaense - UNIPAR, no outono de2006. Um exemplar da espécie se encontra de-positada no Herbário do Departamento de Bio-logia da Universidade Estadual de Maringá, sobnúmero de registro 4714 HUM. As folhas foramsecas em estufa de ar circulante a 35 °C, moídaspara a obtenção do extrato etanólico. Para a ob-tenção do extrato as folhas moídas foram sub-metidas à extração por Soxhlet com os seguintessolventes: hexano, clorofórmio e etanol (300 gde planta moída e seca). O rendimento do ex-trato etanólico liofilizado foi de 29,30 g.  Animais Foram utilizados ratos machos Wistar (n =55), com peso entre 250 e 350 g. Divididos em 5grupos de 11 animais, onde de cada grupo osgranulomas de 6 animais foram utilizados parasecagem e pesagem e os granulomas de 5 ani-mais foram utilizados nos teses bioquímicos, osgrupos foram divididos em: grupo tratado extrato25 mg/kg, grupo tratado extrato 50 mg/kg, grupotratado extrato 100 mg/kg, grupo controle positi- vo tratado com indometacina 5 mg/kg e grupocontrole negativo administrado água. Estes forammantidos sete dias, e durante o desenvolvimentodo estudo, a uma temperatura de 20 ±2 °C, eumidade relativa 50-70% em um ciclo de claro eescuro de 12/12 h. Tiveram livre acesso ao ali-mento (dieta padrão para roedores) e água. Todos os procedimentos foram realizados se-gundo recomendações do Comitê Internacionalpara os cuidados dos animais e estão em acordocom os regulamentos nacionais estabelecidospara a experimentação animal. O projeto foisubmetido e aprovado pelo Comitê de ética emPesquisa Animal da Universidade Paranaense -UNIPAR, com protocolo de aprovação N°10.236/2007.  Implante dos blocos de algodão Os blocos de algodão com peso aproximadode 50 ±5 mg foram secos a 60 °C durante 18horas em estufa, posteriormente foram anotadosos pesos e esterilizados em autoclave.Utilizando a metodologia descrita por Bailey  14 , os animais foram pesados e em seguida, inje-tados tiletamina (50 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg)por animal, por via IM. A região abdominal dorato foi lavada com sabão, após foi raspada edesinfetada com solução anti-séptica PVPI. Fez-se uma incisão em torno de 6 mm na linha mé-dia da zona ventral, posteriormente separou-secuidadosamente a derme da parede do peritô-nio e com o auxilio de uma pinça hemostáticareta realizou-se túneis até as laterais, de umaamplitude aproximada de 1 cm e longitudinal-mente de 5 cm, pela qual se introduziu o blocode algodão o qual foi colocado dentro de umaseringa hipodérmica plástica de 1 ml, na mesmafoi eliminada a região do cone para permitir asaída do bloco de algodão. Uma vez situado obloco no final do túnel, o mesmo foi fechadocom um ponto externo para que o bloco de al-godão não se deslocasse. Repetiu-se o procedi-mento anterior para as quatro extremidades doabdômen do rato, foram implantados quatroblocos de algodão em cada animal. Ao final dosimplantes suturou-se a incisão inicial com pon-tos de seda cirúrgica. Em seguida, aplicou Nitro-furazona (ungüento) para evitar o canabalismoe proteger os animais de possíveis infecções.  366 PUPO S.C., PÉREZ DAVISON G., MARTINEZ-SÁNCHEZ G., TAKEMURA O.S. SILVA A.V., GONÇALVES G.F. & DELAPORTE R.H.  Após o ato cirúrgico, os animais foram colo-cados imediatamente em incubadora a 37 °Cdurante 3 h (recuperação da anestesia). Poste-riormente foram colocados no local de per-manência nas condições padrão de trabalho. Pa-ra evitar infecções foram mantidos em viruta es-téril.  Tratamento dos animais  Administrou-se por via oral, através de sondaintragástrica respectivamente durante 7 dias paraos grupos tratados com extrato de etanólico de Bouchea fluminensis  25 mg/kg, 50 mg/kg e 100mg/kg, para o grupo controle positivo tratadocom indometacina 5 mg/kg e para o grupo con-trole negativo água, administrando os mesmos volumes em todos os animais.  Extração do granuloma Sete dias depois da implantação do bloco dealgodão, os animais foram novamente pesados,e procedeu-se a eutanásia para a extração dosgranulomas. Após serem cuidadosamente extraí-dos, os mesmos foram lavados com solução fi-siológica e colocados em placas de petri. Osgranulomas destinados aos testes bioquímicosforam embalados hermeticamente e imediata-mente congelados (-80 °C), e os demais granu-lomas foram secos em estufa de circulaçãoforçada de ar a 60 °C por 18 horas, e em segui-da pesados em balança analítica.  TESTES BIOQUÍMICOS  Homogenados de tecidos Teve como objetivo a preparação e a ob-tenção de homogenados de tecidos, utilizandopara isso um homogenizador Marconi - MA099.O fundamento consiste em avaliar distintosparâmetros enzimáticos e bioquímicos direta-mente em tecidos, apresentando a dispersão domesmo em um meio adequado. Os reativos,preparação e procedimento do método segundoThielman 15 e Nakamura et al. 16 .  Determinação de produtos avançados da oxidação de proteínas O objetivo desta determinação é conhecer aconcentração de produtos avançados da oxi-dação de proteínas em amostras biológicas. De-terminou-se seguindo a transformação dos íonsiodo a iodo diatômico que provocam os produ-tos avançados da oxidação de proteínas seguin-do a troca de DO a 340 nm. Utilizou-se comopadrão cloramina T e os resultados expressa-ram-se como µM de cloramina por grama de te-cido. Os reativos, a preparação e procedimentoforam segundo Witko-Sarsat 17 .  ANÁLISE ESTATÍSTICA   A massa dos granulomas foi expressa emmg, sendo calculada a mediana e os percentis25 e 75, por grupo, comparados pelo teste nãoparamétrico de Kruskall-Wallis. Os produtosavançados da oxidação de proteínas (PAOP) fo-ram apresentados segundo a concentração decloramina em (mol/g de tecido, sendo, então, verificada a correlação entre a PAOP e a dosede extrato etanólico de B. fluminensis  pelo cál-culo do coeficiente de correlação não-paramêtri-co de Spearmann, sendo calculado o coeficientede variação e a mediana de PAOP por grupo,comparados entre si pelo método não paramé-trico de Kruskall-Wallis. Em todas as determi-nações doi considerado um nível de significân-cia de 5% 18 . RESULTADOS E DISCUSSÃO O uso de frações terapêuticas em modelosexperimentais animais constitui um dos cami-nhos fundamentais para obtenção de fitoterápi-cos para uma ação eficaz e segura, garantidodessa forma, o uso na terapêutica veterinária ehumana.O tratamento dos animais durante 7 dias le- vou a uma redução significativa no peso do gra-nuloma nas doses testadas de 50 e 100 mg/kgdo extrato de B. fluminensis, conforme demons-trados na Tabela 1. Enquanto não foi observadauma diferença significativa entre os extratos emtodas as doses testadas do extrato (25, 50 e 100mg/kg). Nos experimentos realizados, o pesodos granulomas dos animais tratados com indo-metacina tiveram a menor mediana, quando foiutilizada a dose de 5 mg/kg.O modelo de granuloma em ratos tem sidoutilizado para avaliação da reação inflamatóriacrônica e pode ser utilizado de maneira crônicaou sub-crônica na investigação de substânciasanti-artríticas 19 . Este modelo avalia tanto a fasetransudativa quanto a fase proliferativa da infla-mação crônica. Substâncias antiinflamatórias co-mo MAINEs e também a dexametasona interfe-rem no processo de formação do granuloma su-primindo a fase inicial de infiltração de neutrófi-los no granuloma 14 .No ensaio de avaliação da redução da con-centração de produtos avançados da oxidaçãode proteínas, percebeu-se um significativo efeitode dose-dependência em todas as concen-trações de extrato de B. fluminensis  testadas  367  Latin American Journal of Pharmacy - 27 (3) - 2008 (Tabela 2). A relação dose efeito para este indi-cador teve um coeficiente de correlação de 0,97. A concentração efetiva média para B. fluminen- sis  segundo este efeito foi de 47,26 mg/kg (Min.40,04 mg/kg; Max. 54,49 mg/kg).Os Produtos Avançados da Oxidação de Pro-teínas (PAOP) são os resultados dos processosde fragmentação, entrelaçamento e agregaçãodas proteínas após sua oxidação. Tem sido de-monstrado que PAOP presentes no soro huma-no são capazes de ativar monócitos em sistemas in vitro, e a magnitude da ativação é proporcio-nal a concentração de PAOP. As concentraçõesde PAOP se correlacionam com as de ditirosina(DT) e carbonilas, mas também são resultadosdo entrelaçamento proteícos, dado que DT puri-ficada não srcina ativação de monócitos 20 .Os PAOP são marcadores recentes do danooxidativo à proteína. E este trabalho é provavel-mente o primeiro a utilizar esta metodologia nacaracterização bioquímica do modelo de granu-loma. Pode-se apreciar as diferenças altamentesignificativas (p < 0,01) entre o grupo controlenegativo e o grupo controle positivo (indometa-cina). Por outro lado, este indicador foi tambémsignificativamente diferente (p < 0,01) entre to-dos os grupos tratados com diferentes doses de B. fluminensis.  A utilização deste indicador atribui umagrande sensibilidade ao método, e foi apartirdestes dados que a dose efetiva média foi calcu-lada. O método gravimétrico baseado no pesoseco do granuloma pode induzir a um erromaior.Os PAOP srcinam-se basicamente por clo-ração das proteínas, esta cloração somente épossível por ação de células polimorfonuclearesque contém a enzima mieloperoxidase. Este é o Grupo Mediana P25 P75  Água177,50 c 139,00216,00BF 25 mg122,00 bc 88,00235,00BF 50 mg119,00 b 89,00122,00BF 100 mg110,00 b 88,00204,00Indometacina93,00 a 81,0099,00  Tabela 1 . Efeito do extrato etanólico de B. fluminen- sis  na formação de granuloma em ratos. Mediana,percentil 25 e percentil 75 da massa (mg) de granulo-mas obtidos de ratos tratados com 25, 50 ou 100 mgde extrato de Bouchea fluminensis  (BF), com indo-metacina ou água. Valores de mediana seguidos deletras diferentes indicam diferenças significativas en-tre os grupos pelo teste não-paramétrico de Kruskall- Wallis, para um nível de significância α =0,05. Grupo Mediana Coeficiente de variação (%)  Água573,84 a 20,44BF 25 mg392,94 c 11,13BF 50 mg239,62 d 14,36BF 100 mg96,42 e 21,72Indometacina46,14 b 18,26  Tabela 2 . Concentração de Produtos Avançados deOxidação de Proteínas em granuloma dos grupos emestudo (µmol de cloramina/g de tecido). Valor demediana seguido de letras diferentes indicam dife-renças significativas entre os grupos pelo teste não-paramétrico de Kruskall-Wallis, para um nível de sig-nificância α =0,01. motivo que PAOP é um marcador muito seletivodo processo inflamatório e da migração de poli-morfos ao sítio inflamado. PAOP tem sido acres-centado em numerosas desordens inflamatóriasem seres humanos, como pacientes HIV  21 , emuremia 22,23 , diabetes tipo 2 24 e outros transtor-nos inflamatórios 25 .Os PAOP não são somente derivados da oxi-dação de proteínas, assim como, tem atividadebiológica e esta atividade potencia o processoinflamatório e faz possível a síntese de citoqui-nas e a perpetuação da reação inflamatória 20 . CONCLUSÃO Com foi demonstrado, a fração etanólica de B. fluminensis  possui um significativo efeito an-tiinflamatório no modelo de inflamação crônica. A potência comparada com a substância de re-ferência (indometacina 5 mg/kg) foi baixa, masdeve-se levar em consideração que o extrato éuma mistura de princípios ativos e não umasubstância pura. Por outro lado, é provável queos efeitos adversos deste extrato natural sejammuito menores que os reportados para a indo-metacina. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1.Valente, F.L.S. 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