of 9

МОРФОЛОГІЧНИЙ ТА ГЕНЕТИЧ

32 views
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Share
Description
Проблема видового визначення зелених жаб пов'язана з гібридним способом відтворення особин Pelophylax esculentus. Гібрид успадковує гени обох батьків: жаби озерної Pelophylax ridibundus і жаби ставкової Pelophylax lessonae. Було встановлено, що
Tags
Transcript
  ISSN 0206-5657. Вісник Львівського університету. Серія біологічна. 2014. Випуск 64. С. 241–249   Visnyk of the Lviv University. Series BIology. 2014. Issue 64. P. 241–249 © Стах В., Белоконь М., Хамар І. та ін., 2014УДК 597.851:591.151(477.83) МОРФОЛОГІЧНИЙ ТА ГЕНЕТИЧНИЙ ПОЛІМОРФІЗМ ЗЕЛЕНИХ ЖАБ (  PELOPHYLAX  ) ВОДОЙМ ЗАХІДНОЇ УКРАЇНИВ. Стах 1 , М. Белоконь 2 , І. Хамар 1 , Ю. Белоконь 2 , О. Решетило 3 1  Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського, 4, Львів 79005, Україна 2  Інститут загальної генетики імені М.І. Вавілова РАН вул. Губкіна, 3, Москва 119991, Росія 3  Інститут екології Карпат НАН України вул. Козельницька, 4, Львів 79026, Україна e-mail: vstax_77@mail.ru Проблема видового визначення зелених жаб пов’язана з гібридним способом відтворення особин  Pelophylax esculentus . Гібрид успадковує гени обох батьків: жаби озерної  Pelophylax ridibundus  і жаби ставкової  Pelophylax lessonae . Було встановлено, що чотири з досліджених особин є типовим прикладом геміклонального успадкування, а їхня локалізація не зумовлена географічними умовами. Порівнявши дані генетичного та морфологічного аналізів, встановили, що під час визначення видової приналежності особин зелених жаб у польових умовах оптимальним є використання індексу F/T. За його допомогою точність визначення особин зелених жаб до виду становить 70%.  Ключові слова:  клептон, мікросателітні локуси, жаба озерна, жаба ставкова, жаба їстівна, Західна Україна. На даний час актуальним серед сучасних напрямів зоології є дослідження тварин з особливим характером таксономічного статусу та специфічних еволюційних взаємовідносин, що ми і спостерігаємо у деяких земноводних, зокрема у представників  роду  Pelophylax . Вони представлені у Львівській та Волинській областях трьома видами: жабою озерною –  Pelophylax ridibundus  [Pallas, 1771], ставковою –  Pelophylax lessonae [Ca - merano, 1882 «1881»] та їхнім гібридом – їстівною –  Pelophylax esculentus [Linnaeus, 1758]. Оскільки в даному випадку спостерігається нетрадиційне успадкування при утворенні гібридних форм, та передавання у мейозі, як правило, геномів одного із батьківських видів, то це і стало причиною тверджень про причетність останнього виду до нової еволюційно-таксономічної одиниці – «клептону», та про наявність напівклонального (геміклонального)  розмноження.До останнього часу для встановлення видової приналежності зелених жаб використовувалися здебільшого морфометричні методи. Л. Бергер [15] вказував на діагностичність таких показників, як відношення довжини стегна до довжини гомілки (F/T), довжини першого пальця задньої кінцівки до довжини внутрішньоп’яткового горбка (D.p./L.t.ci.), довжини гомілки до довжини внутрішньоп’яткового горбка (T./L.t.ci.). У 80-х роках С.В. Таращук [13] для вибірок чисельністю не менше 20 особин запропонував узагальнений мультиплікативний індекс: Ix=T/L.t.ci.*D.p./L.t.ci.*T/L.c.s. Для кожного виду встановлені межі індексу, проте в літературних джерелах подаються різні показники мінімуму та максимуму, наприклад:  P. lessonae  < 20 <  P. esculentus  < 32 <  P. ridibun - dus  [8];  P. lessonae  < 22 <  P. esculentus < 42 <  P. ridibundus  [13]. Дослідження гібридних популяцій із Центральної Чорноземної зони Росії показали наявність перекривання п’яти морфологічних індексів ставкової, їстівної та озерної жаб у разі окремих особин, але у разі  В. Стах, М. Белоконь, І. Хамар та ін.   ISSN 0206-5657. Вісник Львівського університету. Серія біологічна. 2014. Випуск 64 242 численних вибірок середні морфологічні індекси можуть вважатися досить надійними [18]. Таким чином, морфологічний метод визначення окремих особин не є абсолютно точним. Зважаючи на це, різними дослідниками були запропоновані різноманітні генетичні методи встановлення видової приналежності.Методом проточної цитометрії встановлено, що розмір геному  P.   ridibundus  перевищує розмір геному  P. lessonae  на 16%, а геном  P. esculentus , який утворився в  результаті об’єднання геномів батьківських видів, займає проміжне положення [2, 18]. Окрім точного встановлення видової приналежності особини, цей метод дає можливість визначати плоїдність геному.Для визначення виду у зелених жаб застосовують також аналіз ізоферментів, що кодуються ядерними та мітохондріальними генами. Діагностичними можуть вважатися локуси альбуміну (  Alb ), лактатдегідрогенази (  Ldh-B ), естерази (  Es-1 ) й аспартатамінотрансферази (  Aat -1,-2 ) [4–6].За останнє десятиліття значного поширення набули таксономічні дослідження зелених жаб за допомогою аналізу мікросателітних послідовностей ДНК. Ядерні мікросателітні локуси високополіморфні, успадковуються кодомінантно і тому є зручним інструментом для вивчення генетичної структури популяцій. З метою вивчення цих локусів геному зелених жаб комплексу  P. ridibundus  –   P. esculentus – P. lessonae  були розроблені видоспецифічні праймери [16, 17, 22].Проточна цитометрія та ізоферментний аналіз потребують відбору значної кількості біологічного матеріалу (крові, м’язової тканини), під час якого жаба гине і таким чином вилучається з популяції. На противагу цьому, аналіз мікросателітних локусів поєднує в собі точність визначення виду і можливість прижиттєвого збору проб для аналізу без завдання шкоди досліджуваній тварині [21]. На території України порівняння видів за допомогою мікросателітних послідовностей ДНК раніше не проводилось.Метою нашої роботи було з’ясування особливостей морфометричних ознак і проведення аналізу мікросателітних послідовностей ДНК зелених жаб Львівської та Волинської областей.Для досягнення мети були поставлені такі завдання: проаналізувати основні таксономічно важливі морфологічні ознаки та їхню мінливість (індекс F/T, мультиплікативний індекс); визначити видову приналежність особин зелених жаб за генотипами 10 мікросателітних локусів; порівняти морфометричні та генетичні результати визначення видів. Матеріал і методи Матеріал відбирали у польових умовах за допомогою батрахологічного сачка. У водоймах смт Нижанковичі (Львівська обл., Старосамбірський р-н.; 49 о 40’34» пн.ш., 22 о 48’30» сх.д.) було відібрано 31 особину; водоймах орнітологічого заказника «Чолгині» (Львівська обл., Яворівський р-н.; 49 о 55’14» пн.ш., 23 о 26’11») – 42 особини; озері Пісочне (Волинська обл., Шацький р-н.; 51 о 27’39»пн.ш., 24 о 34’26» сх.д.) – 12 особин; озері Луки (Волинська обл., Шацький р-н.; 51 о 33’15» пн.ш., 24 о 20’37» сх.д.) – 9 особин. Через незначну кількість особин зелених жаб, відібраних у Шацькому національному природному парку, вибірки з озер Луки та Пісочне були об’єднані.Морфологічній частині досліджень передувала робота з вивчення проявів мінливості зовнішніх морфологічних ознак і можливостей їх використання в еволюційно-таксономічному аналізі:  L.  (довжина тіла);  L.c.  (довжина голови);  Lt.c.  (ширина голови);  D.r.-o.  (відстань від кінця морди до ока);  D.r.-n.  (відстань від ніздрі до кінця морди);  Lt.r.  (ширина рила);  L.o.  (довжина ока); Sp.in.  (проміжок між очима);  D.n.-o.  (відстань від ніздрі  В. Стах, М. Белоконь, І. Хамар та ін.   ISSN 0206-5657. Вісник Львівського університету. Серія біологічна. 2014. Випуск 64  243 до переднього краю ока);  Lt.p.  (ширина повіки); Sp.ip.  (проміжок між повіками);  L.tym.  (найбільша довжина барабанної перетинки);  D.tym.-o.  (відстань від барабанної перетинки до заднього краю ока);  L.m.  (довжина передньої лапи);  Lt.m.  (ширина п’ястя);  D.p.  (довжина першого пальця передньої кінцівки);  F.  (довжина стегна); Т. (довжина гомілки);  L.c.s.  (довжина додаткової гомілки);  Lt.c.s.  (ширина додаткової гомілки);  D.h.  (довжина першого пальця задньої кінцівки);  D.q.  (довжина четвертого пальця задньої кінцівки);  L.t.ci.  (довжина внутрішньоп’яткового горбка);  A.t.ci.  (ширина внутрішньоп’яткового горбка) [1, 3, 7, 11, 12, 14].ДНК виділяли із фіксованих у 70% етиловому спирті м’язових тканин, а також із зразків епітелію ротової порожнини, зібраних на ватні палички за методикою Н. Підансьє та співавторів [21]. Для виділення використовували універсальні набори “Diatom™ DNA Prep” виробництва ООО «Лаборатория Изоген» (Росія). У результаті аналізу літературних джерел і лабораторного тестування було відібрано 10 пар праймерів для ампліфікації мікросателітних локусів у зелених жаб, більшість із яких є діагностичними для визначення виду –  Rrid059,  Rrid082, Rrid171 [17];  Res5, Res14, Res16, Res22  [22];  RlCA1b5, RlCA18,    RlCA19 [16]. Для проведення ПЛР використовували готові суміші реагентів із наборів для ПЛР-ампліфікації GenePak  ®  PCR Core виробництва ООО «Лаборатория Изоген» (Росія). Електрофоретичне  розділення отриманих фрагментів ДНК проводили в 6% поліакриламідному гелі, з використанням тріс-ЕДТА-боратного електродного буферу (ТБЕ). Для визначення довжин фрагментів у кожну гелеву пластинку поряд із досліджуваними зразками вносили маркер довжин ДНК – плазміду  E. coli  pBR322, оброблену ендонуклеазою рестрикції HpaII. Статистичну обробку отриманих результатів проводили у програмі GenAlEx 6.41 із використанням модуля Population Assignment [19, 20]. Результати і їхнє обговорення Протягом 2011–2012 років нами для аналізу морфометричних і фенотипних показників було відібрано 94 особини. Кількісне співвідношення видів для кожної вибірки наведено в табл. 1.На підставі аналізу літературних і одержаних власних даних щодо морфологічного опису зелених жаб ми дійшли висновку, що лише співвідношення деяких із них може використовуватися під час визначення виду. Таблиця 1 Видова приналежність зелених жаб у вибірках із водойм Західної України за морфометричними ознаками та результатами генетичного аналізу ВидКількість особин, які належать до даного виду за відповідними показниками    М  о  р   ф  о  м  е  т  р  и  ч  н   і  о  з  н  а  к  и   А  н  а  л   і  з  м   і  к  р  о  с  а  т  е  л   і  т  н  и  х   Д   Н   К   З   б   і  г  в  и  д  о  в  о   ї  п  р  и  н  а  л  е  ж  н  о  с  т   і   *   М  о  р   ф  о  м  е  т  р  и  ч  н   і  о  з  н  а  к  и   А  н  а  л   і  з  м   і  к  р  о  с  а  т  е  л   і  т  н  и  х   Д   Н   К   З   б   і  г  в  и  д  о  в  о   ї  п  р  и  н  а  л  е  ж  н  о  с  т   і   *   М  о  р   ф  о  м  е  т  р  и  ч  н   і  о  з  н  а  к  и   А  н  а  л   і  з  м   і  к  р  о  с  а  т  е  л   і  т  н  и  х   Д   Н   К   З   б   і  г  в  и  д  о  в  о   ї  п  р  и  н  а  л  е  ж  н  о  с  т   і   * «Чолгині»«Шацьк»«Нижанковичі»  P. ridibundus 201814352313131  P. lessonae 1518111222–––   P. esculentus 7616126––– Разом  42 4226  21 1910  31 3131 Примітка:  * – збіг видової приналежності за морфометричними ознаками та результатами генетичного аналізу.  В. Стах, М. Белоконь, І. Хамар та ін.   ISSN 0206-5657. Вісник Львівського університету. Серія біологічна. 2014. Випуск 64 244  Як уже наголошувалося, не менш важливим для визначення виду є співвідношення довжини стегна (F) до довжини гомілки (T). Індекс F/T доволі часто використовується як основний критерій під час визначення видової приналежності зелених жаб. У озерної жаби стегно коротше від гомілки, тому індекс F/T є меншим від одиниці, а у ставкової – задньогомілкові зчленування заходять одне за одне, тобто індекс F/T більший від одиниці. Їстівна ж жаба характеризується проміжними даними, тобто F/T=1, і задньогомілкові зчленування торкаються одне одного [10]. Значення індексу F/T для досліджених нами жаб наведено у табл. 2.Таблиця 2Значення індексу F/T для зелених жаб Західної України ВидТериторіяF/T (за морфотипом)F/T (за генотипом)  P. lessonae  Чолгині1,061,02  P. ridibundus  Чолгині0,930,94  P. esculentus  Чолгині0,990,99  P. lessonae НижанковичіНемає вибіркиНемає вибірки  P. ridibundus Нижанковичі0,950,95  P. esculentus НижанковичіНемає вибіркиНемає вибірки  P. lessonae Шацьк1,031,04  P. esculentus Шацьк11,02  P. ridibundus Шацьк0,950,99 Значний збіг індексу F/T з даними розподілу на групи за генотипами показує, що цей індекс можна вважати досить інформативним у визначенні виду. Визначення за допомогою цього індексу 70% особин підтвердилися і аналізом мікросателітної ДНК (табл. 1). Тобто видова приналежність 66 особин, визначена за допомогою індексу F/T, була підтверджена  результатами мікросателітного аналізу.У результаті аналізу мінливості за 10 мікросателітними локусами були встановлені індивідуальні генотипи жаб і розраховані частоти алелів у досліджених вибірках (табл. 3). Локуси  Rrid059 ,  RlCA1b5 і Res22  можна вважати діагностичними для визначення виду, оскільки їхні алелі, виявлені у дослідженні, є видоспецифічними. У  P. lessonae  в локусі  Res22 , крім алелів, що ампліфікуються, виявлено «ноль»-алель, наявність якого може вплинути на точність встановлення видової приналежності. Наявність «ноль»-алелів у генотипах окремих особин пов’язана з відсутністю в їхніх геномах послідовностей ДНК, комплементарних до праймерів досліджуваного мікросателітного локусу. У генотипах особин гетерозиготних за даним локусом «ноль»-алелі можуть не виявлятися, тому зазначений локус можна використовувати лише разом з іншими діагностичними локусами. «Ноль»-алелі виявлено також у локусах  Res14  у обох видів,  Res16   – у  P. lessonae ,  Res5  – у  P. ridibundus ,   а локус  RlCA18  ампліфікується лише у зразках  P. lessonae  і  P. esculentus . Виявлено спільні для обох видів алелі локусів  Rrid171 ,  Res14 ,  Res16   і  Res5 . Наявність неампліфікованих алелів і алелів, що трапляються у генотипах представників обох видів, не дає змоги використати більшість локусів для визначення видової приналежності, але їх високий поліморфізм дає можливість оцінити диференціацію індивідуальних генотипів.Ми провели порівняння генотипів усіх досліджених жаб і встановили для них приналежність до генетичних груп на основі подібності. Сумарні генотипні дані з включенням вибірки  P. ridibundus  з чистої популяції Нижанкович показують досить чіткий  розподіл на два батьківських види  P. ridibundus ,  P. lessonae  та перехідну генотипну групу  P. esculentus  (див. рисунок).  В. Стах, М. Белоконь, І. Хамар та ін.   ISSN 0206-5657. Вісник Львівського університету. Серія біологічна. 2014. Випуск 64  245 Таблиця 3 Частоти алелів десяти мікросателітних локусів жаб Локус    А  л  е  л  ь    P .  r   i   d   i   b  u  n   d  u  s    (   Н   )   *    P .  r   i   d   i   b  u  n   d  u  s    (   Ч   Ш   )    P .   l  e  s  s  o  n  a  e    (   Ч   Ш   )    P .  e  s  c  u   l  e  n   t  u  s    (   Ч   Ш   ) Локус    А  л  е  л  ь    P .  r   i   d   i   b  u  n   d  u  s    (   Н   )   *    P .  r   i   d   i   b  u  n   d  u  s    (   Ч   Ш   )    P .   l  e  s  s  o  n  a  e    (   Ч   Ш   )    P .  e  s  c  u   l  e  n   t  u  s    (   Ч   Ш   )  Rrid059  103 0,0000,0001,0000,500  RlCA1b5   123 0,0000,0001,0000,452 125 0,2170,2950,0000,190  137 0,0000,2270,0000,143 127 0,0830,1140,0000,024  139 1,0000,6820,0000,333 133 0,0170,0000,0000,000  141 0,0000,0910,0000,071 135 0,1830,0910,0000,000  Res14  135 0,0330,0450,1110,262 137 0,1330,1820,0000,167  141 0,0000,0910,3330,024 139 0,1670,2270,0000,119  143 0,0000,0230,1110,095 141 0,0330,0450,0000,000  147 0,5500,3410,0000,048 143 0,0170,0000,0000,000  149 0,2500,3180,0000,048 145 0,0330,0000,0000,000  null 0,1670,1820,4440,524 147 0,0670,0450,0000,000  RlCA18  175 0,0000,0000,0560,000 149 0,0500,0000,0000,000  181 0,0000,0000,2220,071  Rrid171  173 0,0000,0230,0560,000  183 0,0000,0000,1390,024 175 0,0670,0000,1110,048  185 0,0000,0000,1110,048 177 0,0000,0680,3330,405  187 0,0000,0230,1390,095 179 0,0000,0000,1110,000  191 0,0000,0000,1670,429 181 0,8000,7500,1110,429  193 0,0000,0000,0280,143 183 0,0000,0000,1110,024  195 0,0000,0000,0280,048 185 0,0000,0680,0560,000  199 0,0000,0230,0000,000 187 0,0000,0000,0280,000  null 1,0000,9550,1110,143 193 0,1330,0910,0830,048  Res5   143 0,0000,3860,0000,000 201 0,0000,0000,0280,024  145 0,0000,0680,0830,048 205 0,0000,0000,0560,024  147 0,2670,2730,5000,833 117 0,2670,2500,0000,738  149 0,0000,0000,3330,119 121 0,1330,1140,0000,048  153 0,0000,0000,0280,000 135 0,0000,0680,0000,071  167 0,0000,0000,0560,000 137 0,4500,0910,0000,000  null 0,7330,2730,0000,000 139 0,1000,0000,0000,048  Res22  91 0,0500,4550,0000,000 null 0,0000,0000,1110,000  93 0,0000,0230,0000,000  Res16   120 0,0170,1820,0000,000  105 0,0000,0000,8330,095 122 0,3000,1590,0000,000  109 0,0000,0000,0560,000 124 0,1670,1140,0000,000  Rrid082  163 0,2000,1820,1390,095 126 0,0830,0680,6670,357  165 0,1170,4090,2500,310 128 0,0000,0000,0000,048  183 0,6830,4090,3060,548 132 0,0000,2270,0000,190  195 0,0000,0000,0280,047 134 0,4330,2500,0000,262  201 0,0000,0000,0280,000 null 0,0000,0000,3330,143  207 0,0000,0000,2500,000  RlCA19  111 0,0000,0451,0000,952 113 1,0000,9550,0000,048 Примітка:  * – Н – Нижанковичі, ЧШ – Чолгині + Шацьк сумарно. У результаті проведеного аналізу наявності певних алелів за 10 мікросателітними локусами зразки № 40, 50, 51, 53, 73, визначені морфологічно як  P.   lessonae,  і № 62, 66, 74 визначені як  P.   esculentus,  були віднесені до  P.   ridibundus ;   зразки  P.   ridibundus № 59, 79, 81, 82 і  P.   esculentus  № 44, 60, 63 – до  P.   lessonae ; зразки  P.   lessonae  № 54, 57, 58, 89, 93 і  P. ridibundus № 55, 85 – до  P. esculentus.  Слід зазначити, що генотипи зразків 61 і 64 за діагностичним локусом  Rrid059А  повністю відповідали  P. ridibundus , але за локусом  RlCA1b5  у них, крім варіанта властивого для  P.   ridibundus , був виявлений алель 123, характерний для  P.   lessonae . Екземпляр № 93, визначений за генотипом  RlCA1b5  як  P.   ri -
Related Search
Related Docs
View more...
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks